新型冠狀病毒是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第七種感染人體的冠狀病毒,，屬于單股正鏈ＲNA病毒,，其基因組大小為27～31kb。之前發(fā)現(xiàn)的6種冠狀病毒中,，229E,、OC43、NL63以及HKU可引起輕微呼吸道疾病,，SAＲS冠狀病毒和MEＲS冠狀病毒則能夠引起嚴(yán)重呼吸道疾病,。根據(jù)血清學(xué)和基因組特點(diǎn)，冠狀病毒可分為α,，β,，γ，δ四個(gè)屬,，此次分離得到的新型冠狀病毒屬于β型,。根據(jù)當(dāng)前新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)的規(guī)定，疑似病例同時(shí)具備以下病原學(xué)或血清學(xué)證據(jù)(實(shí)時(shí)熒光ＲT-PCＲ檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽(yáng)性,、病毒基因測(cè)序與已知新型冠狀病毒高度同源,、血清新型冠狀病毒特異性IgM和IgG抗體陽(yáng)性、血清新型冠狀病毒特異性抗體IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高)之一,，即可確診為新型冠狀病毒肺炎患者,。考慮到全球各地的復(fù)雜情況,，新型冠狀病毒短期內(nèi)得到完全控制的可能性很小,，這就對(duì)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度、檢測(cè)流程的合理性以及一次性病毒采樣管內(nèi)檢測(cè)試劑質(zhì)量的可靠性提出了較高的要求,。

由于病毒基因組測(cè)序?qū)夹g(shù),、設(shè)備、操作人員的要求較高,，特異性抗體檢測(cè)具有較長(zhǎng)窗口期,，而核酸擴(kuò)增的方法具有窗口期短、檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),，因此通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCＲ檢測(cè)新型冠狀病毒成為各大醫(yī)院的選擇,。然而根據(jù)全國(guó)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果報(bào)告,，樣本號(hào)2020002(即陽(yáng)性參考品濃度為640copies/mL時(shí))，實(shí)時(shí)熒光PCＲ檢測(cè)的符合率僅有84．9%,，同時(shí)復(fù)檢率高達(dá)30．7%,，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增方法符合率僅有60%，復(fù)檢率高達(dá)40%,，說(shuō)明現(xiàn)有核酸檢測(cè)方法存在弊端,，在樣品濃度偏低時(shí)，假陰性現(xiàn)象非常明顯,。臨床數(shù)據(jù)顯示，新冠病毒潛伏期大約為14d,，個(gè)別患者甚至達(dá)到29d,，病毒在潛伏期時(shí)數(shù)量增長(zhǎng)及臨床癥狀不明顯。這部分新冠病毒感染者的發(fā)病周期長(zhǎng),，前期病毒載量少,，不易于檢測(cè)確診，但其感染性卻未降低,，目前的檢測(cè)方法對(duì)于這部分病毒載量較低感染者的篩查非常容易漏檢,。

新型冠狀病毒核酸檢測(cè)整個(gè)流程分為樣本采集、樣本處理,、上機(jī)檢測(cè)3個(gè)步驟,，越是靠前的步驟，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響也越大,，尤其是對(duì)陽(yáng)性臨界樣本,。關(guān)于樣本采集，各個(gè)醫(yī)院和專家已達(dá)成共識(shí):普通棉簽拭子的核酸檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子,，下呼吸道標(biāo)本檢出率高于上呼吸道標(biāo)本檢出率,。不同樣本類型新型冠狀病毒核酸檢出率從高到低排序依次為:支氣管肺泡灌洗液＞抽吸痰或咳痰＞鼻咽拭子或口咽拭子＞鼻拭子。大部分廠家和機(jī)構(gòu)都充分考慮了樣本檢測(cè)的環(huán)節(jié),，但是在樣本處理環(huán)節(jié)卻少有考慮,。

目前磁珠法作為臨床檢測(cè)的主流方法，優(yōu)點(diǎn)是易于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)提取,，在節(jié)約人力和時(shí)間方面具有優(yōu)勢(shì),，缺點(diǎn)是難以處理大體積的樣本。離心柱法的核酸提取效果優(yōu)于磁珠法,，在檢測(cè)靈敏度方面具有優(yōu)勢(shì)而且利于較大限度地利用樣本,，但缺點(diǎn)是不利于自動(dòng)化處理，所以綜合兩種方法的優(yōu)勢(shì),，開(kāi)發(fā)全自動(dòng)的柱提取法將對(duì)醫(yī)院大批量的樣本檢測(cè)帶來(lái)幫助,?？紤]到自動(dòng)化的重要性，用真空法過(guò)柱可能是一個(gè)有潛力的發(fā)展方向,。保存液的pH會(huì)影響樣本核酸的掛柱效果,，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著保存液pH的降低,，檢測(cè)所得的Ct值也降低,，表明低pH更有利于假病毒樣本的核酸提取。在保存液的利用方面,，本研究分別取2005L和3mL保存液提取核酸,，Ct值相差3.68，根據(jù)Ct值與反應(yīng)體系中模板量的線性關(guān)系可得知,，這相當(dāng)于檢測(cè)靈敏度相差10倍以上,，表明可在實(shí)際檢測(cè)中盡可能充分地利用樣本保存液，有利于減少假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn),。

值得注意的是,，當(dāng)病毒采樣管內(nèi)保存液體積分別為1,2,3mL時(shí)，最終檢測(cè)所得的Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,，表明不同體積的保存液中假病毒的濃度幾乎相同,。這一結(jié)果也說(shuō)明，不同體積保存液洗脫病毒的效率差異很大,，當(dāng)保存液體積變小時(shí),，從拭子上洗脫的假病毒總量也減少，導(dǎo)致洗脫下來(lái)的假病毒濃度基本保持不變,。因此在實(shí)際檢驗(yàn)中,，過(guò)少的保存液體積并不能帶來(lái)更高濃度的病毒溶液，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)增大保存液的體積,，這有利于拭子上的病毒樣本充分釋放,。為了探究最合適的保存液體積，本研究用添加到拭子上和直接添加兩種方式,，分別將相同數(shù)量假病毒分別添加到保存液中,，發(fā)現(xiàn)保存液體積采用IrL.2rL時(shí)，兩種方式的Ct值分別相差1.38.0.59,，表明拭子上的假病毒樣本并沒(méi)有完全釋放到保存液中,，并且隨著保存液體積增大，假病毒也釋放得更充分;當(dāng)保存液體積達(dá)到3mL時(shí),，兩種方式的Ct值相差0.11,，假病毒接近完全洗脫，因此3mL是一個(gè)比較理想的保存液體積,。

本研究采用離心柱法進(jìn)行樣本的RNA提取,，使用無(wú)核酸酶的水洗脫,，這樣所純化的RNA較純掙，抑制成分較少,。隨著反應(yīng)體系中RNA模板的量增大,，Ct值相應(yīng)減小。檢測(cè)臨床樣本時(shí),，在盡量去除PCR抑制成分的前提下,，增加PCR體系中的模板量有利于提高檢測(cè)靈敏度。

基于以上研究,，本研究提出了最優(yōu)的檢測(cè)方案:在正確取樣的前提下,，使用偏酸性的樣本保存液，并采用理想的保存液體積,，將盡量多的保存液采用柱法提取核酸,，最后將較大限度的核酸加入PCH體系。將最優(yōu)檢測(cè)方案和目前常規(guī)操作進(jìn)行對(duì)比,，發(fā)現(xiàn)兩種方案的檢測(cè)靈敏度相差10倍。因此采用本研究的最優(yōu)方案可以較大限度地提高實(shí)際檢測(cè)靈敏度,，減少核酸檢測(cè)的假陰性現(xiàn)象,。